Fractionnement tissulaire et cellulaire
La purification des organites et composants cellulaires nécessite la fragmentation des cellules et leur tri en fonction de la taille, de la densité ou de marqueurs spécifiques. Les cellules peuvent être obtenues par dissociation de tissus ou par culture.
Culture cellulaire
La culture des cellules procaryotes est généralement simple ; la culture de cellules eucaryotes est plus complexe et requiert une grande expertise. Les conditions de culture des cellules animales impliquent un milieu liquide respectant la température (37 °C), la pression partielle en CO₂ (~5 %), une atmosphère humide, une osmolarité et un pH adaptés ainsi que des sources de carbone, d’énergie et des facteurs de croissance. Des antibiotiques et fongicides préviennent les contaminations, et la conservation des cellules se fait à des températures très basses (≤ –130 °C).
Culture primaire et repiquage
Les cultures primaires proviennent de biopsies de tissus dissociés mécaniquement ou par des enzymes (trypsine, collagénase) ; les cellules sont mises en boîte ou en flacon contenant le milieu de culture pour qu’elles se multiplient. Après quelques divisions, une sous‑culture (repiquage) est réalisée en dissociant et diluant les cellules dans un milieu neuf. La durée de vie des cultures primaires est limitée à environ cent repiquages, après quoi les cellules entrent en sénescence.
Homogénéisation cellulaire
L’homogénéisation rompt les membranes cellulaires pour libérer les constituants. Plusieurs méthodes sont possibles, souvent combinées : broyage mécanique, homogénéisateur à piston, ultrasons (sonication) ou cycles de congélation/décongélation.
Séparation subcellulaire : centrifugation
La centrifugation sépare rapidement les particules selon leur densité en les soumettant à une force centrifuge. Les ultracentrifugeuses atteignent des accélérations de plus de 30 000 g.
Centrifugation différentielle
À partir d’un homogénat de cellules, on effectue des centrifugations successives à des vitesses et durées croissantes. Chaque centrifugation sépare un culot et un surnageant correspondant à différentes fractions (noyaux, mitochondries, microsomes…).
Centrifugation à l’équilibre (sur gradient de densité)
On utilise un solvant présentant un gradient de densités ; chaque constituant migre jusqu’à la zone où sa densité égale celle du solvant. La vitesse de sédimentation n’intervient pas et les particules doivent être centrifugées longtemps (4–20 h). Les fractions sont ensuite récupérées successivement.
Séparation des macromolécules
Deux grandes catégories de techniques permettent de séparer et caractériser les macromolécules : l’électrophorèse et la chromatographie.
Électrophorèse
Lors d’une électrophorèse, un champ électrique fait migrer des molécules chargées dans un support gélifié (agarose ou polyacrylamide). La vitesse de migration dépend de la forme, du nombre de charges et de la masse moléculaire. Chez les protéines, ces paramètres permettent de distinguer différents types d’électrophorèse : isoélectrofocalisation (migration selon un gradient de pH), SDS‑PAGE (le détergent SDS confère une charge négative uniforme et la séparation se fait selon la masse moléculaire). L’électrophorèse bidimensionnelle combine isoélectrofocalisation et SDS‑PAGE.
Chromatographie
La chromatographie sépare les macromolécules selon leurs propriétés et utilise deux phases : une phase fixe (billes) et une phase mobile contenant le mélange à séparer. Après élution, les composants sont récupérés par fractions. Il existe plusieurs types :n- Chromatographie sur couche mince (CCM) : migration par capillarité.n- Chromatographie d’exclusion‑diffusion (gel‑filtration) : séparation selon la masse moléculaire ; les plus petites molécules sont retardées.n- Chromatographie d’affinité : un ligand (ex. anticorps) spécifique d’une molécule est greffé sur la phase fixe ; seule la molécule complémentaire est retenue.n- Chromatographie d’échange d’ions : les molécules sont séparées selon leur charge.