Méthodes moléculaires
Plusieurs techniques moléculaires sont utilisées : incorporation de précurseurs marqués (pulse‑chase), techniques de transfert et manipulation des acides nucléiques.
Pulse‑chase
Le pulse‑chase suit un processus cellulaire dans le temps. Les cellules sont incubées avec un précurseur marqué par un radioisotope (pulse), puis transférées dans un milieu contenant le même précurseur non marqué (chase). L’incorporation du précurseur dans une molécule permet d’en suivre le devenir dans la cellule. Par exemple, le suivi de la synthèse de l’insuline dans les cellules β du pancréas utilise la leucine tritiée et permet de suivre le trajet de l’insuline du réticulum endoplasmique à l’appareil de Golgi et aux vésicules de sécrétion.
Techniques de transfert (blots)
La première technique de transfert, le Southern Blot, digère l’ADN génomique, sépare les fragments par électrophorèse, puis les dénature et les transfère sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose. Les fragments d’intérêt sont détectés par hybridation avec une sonde marquée. Le Northern Blot analyse les produits de transcription (ARN) et le Western Blot transfère et détecte des protéines.
Manipulation des acides nucléiques
Enzymes de restriction
Les enzymes de restriction sont des endonucléases reconnaissant des séquences d’ADN palindromiques de 4 à 10 pb et les clivant au niveau du site de restriction. Certaines libèrent des extrémités franches, mais la plupart donnent des extrémités cohésives. Les enzymes de restriction sont utilisées pour fractionner l’ADN, cloner des fragments ou rechercher des mutations.
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
La technique RFLP met en évidence des polymorphismes de longueur des fragments de restriction. Une mutation qui supprime un site de restriction empêche la coupure et modifie la longueur des fragments obtenus ; à l’inverse, une mutation peut créer un nouveau site. Les fragments sont séparés et analysés pour identifier ces polymorphismes.