Techniques basées sur la fluorescence
Fluorochromes
Les fluorochromes sont des molécules capables d’émettre de la lumière après excitation.
La GFP, protéine fluorescente verte (green fluorescent protein)
La GFP (green fluorescent protein) est une protéine naturellement fluorescente qui émet dans le vert lorsqu’elle est excitée par une lumière bleue ou ultraviolette. En fusionnant le gène de la GFP avec celui d’une protéine d’intérêt, on obtient une protéine chimérique fluorescente, ce qui permet de suivre le destin de cette protéine dans la cellule. Il existe de nombreuses variantes de la GFP émettant à différentes longueurs d’onde, permettant le suivi simultané de plusieurs protéines.
Immunofluorescence
L’immunofluorescence (IF) utilise des anticorps couplés à un fluorochrome ; la fluorescence est observée au microscope à fluorescence ou au cytomètre en flux.
Cytométrie en flux
Le cytomètre en flux (FACS) est un appareil qui trie des cellules marquées par fluorescence. Les cellules passent une à une dans une gaine fluide ; un laser mesure leur nombre, leur taille et leur granulométrie. Les cellules préalablement marquées par des anticorps ou des colorants fluorescents voient leur fluorescence mesurée ; on peut ainsi déterminer la proportion de cellules marquées et trier différentes populations.
FRET (fluorescence resonance energy transfer)
Le FRET mesure l’interaction de deux molécules par transfert d’énergie entre deux fluorochromes. Si les spectres d’émission et d’excitation se chevauchent, l’émission du premier fluorochrome peut exciter le second ; cette interaction n’est possible que si les deux molécules sont séparées de moins de 10 nm.
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)
Cette technique suit la dynamique des protéines dans les membranes. Après marquage fluorescent, une zone est photodécolorée au laser. La recoloration ultérieure indique l’arrivée de nouvelles molécules et permet d’évaluer la mobilité et la diffusion latérale. Les cellules doivent être vivantes, donc le marquage utilise souvent la GFP.