Techniques microscopiques et marquage
Microscopie optique (microscope photonique)
Le microscope optique utilise la lumière visible pour observer des coupes fines de tissus ou des cellules isolées. La qualité de l’image dépend du pouvoir de résolution, lui‑même fonction de la longueur d’onde de la source lumineuse et de l’indice de réfraction du milieu entre la lamelle et l’objectif ; l’huile à immersion améliore cet indice. Avec un microscope photonique, deux points séparés de moins de 0,1 μm ne peuvent pas être distingués. Le grossissement est obtenu par la combinaison de l’oculaire (×10) et des objectifs (×4 à ×100).
La microscopie optique permet d’observer des cellules vivantes ou fixées, mais la plupart nécessitent une coloration. Des colorants vitaux comme le rouge neutre, le bleu de crésyl et le vert Janus marquent les cellules vivantes, tandis que le bleu trypan met en évidence les cellules mortes en étant exclu des cellules viables.
Préparation des échantillons pour le microscope optique
Les tissus subissent plusieurs étapes : fixation (stabilisation des structures au froid ou par des agents chimiques), déshydratation dans des bains d’alcool à concentrations croissantes, inclusion dans une résine ou de la paraffine, coupes fines au microtome, puis réhydratation pour permettre la coloration. Des colorants courants sont l’hématoxyline, l’éosine et le safran (coloration HES).
Microscope à fond clair
Il s’agit du mode d’observation classique où la lumière traverse l’échantillon. Les colorants vitaux ou les colorations histologiques mettent en évidence les structures cellulaires.
Microscope à contraste de phase
Cette technique exploite le retard de phase des faisceaux lumineux traversant des structures à indices de réfraction différents. Elle permet d’observer directement des cellules vivantes et des phénomènes dynamiques (migration, division) sans coloration.
Microscope à épifluorescence
Un microscope à fond clair équipé de filtres peut exciter des molécules fluorescentes et recueillir l’émission à une longueur d’onde plus élevée. Peu de substances sont naturellement fluorescentes ; on utilise donc des marquages avec des fluorochromes. Des filtres d’excitation et d’émission permettent de sélectionner les longueurs d’onde.
Autres microscopes optiques
Le microscope confocal réalise des coupes optiques à différentes profondeurs, produisant une image tridimensionnelle. Le microscope biphotonique associe la focalisation confocale à un laser infrarouge, permettant l’imagerie de couches plus profondes dans les tissus.
Microscopie électronique
Le microscope électronique offre un pouvoir de résolution bien supérieur au microscope optique (jusqu’à 0,2 nanomètre). Un faisceau d’électrons produit par chauffage d’un filament de tungstène est accéléré dans un tube sous vide et focalisé par des lentilles électromagnétiques. L’image est recueillie sur un écran fluorescent ou un film, car elle n’est pas visible à l’œil nu. L’ensemble du système est fixe verticalement.
Préparation des échantillons en microscopie électronique
Les échantillons sont fixés rapidement après le prélèvement, puis déshydratés et inclus dans des résines pour obtenir des coupes ultrafines de 50 à 100 nm. La coloration est réalisée par imprégnation aux métaux lourds (osmium, uranyle, plomb, argent, mercure) pour augmenter le contraste (« coloration positive »). L’ombrage métallique (coloration négative) consiste à vaporiser du platine ou de l’or pour recouvrir certaines surfaces ; il est utilisé notamment après cryofracture pour observer des structures comme les fibrilles de cellulose ou la chromatine. Les techniques d’ombrage donnent des vues en relief des préparations et permettent la visualisation de virus ou de répliques de surface.
Microscope électronique à balayage
Ce microscope utilise un faisceau d’électrons fin qui balaye la surface de l’échantillon point par point ; les électrons secondaires émis sont collectés et amplifiés pour former une image tridimensionnelle. Il permet d’observer des échantillons plus volumineux que le microscope électronique à transmission.
Méthodes immunochimiques
L’immunochimie permet de détecter une molécule dans une cellule (immunocytochimie) ou un tissu (immunohistochimie) grâce à des anticorps spécifiques. Les anticorps sont couplés à une enzyme ou à un fluorochrome ; la révélation se fait par un substrat chromogène ou par fluorescence. On peut utiliser des anticorps secondaires marqués pour augmenter la sensibilité. Les observations se font au microscope photonique ou électronique, notamment lorsque les anticorps sont marqués avec des billes d’or colloïdal.